溫度梯度PCR儀和降落PCR區(qū)別大嗎
更新時間:2016-06-27
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溫度梯度PCR是指在退火溫度不太明確時,為了找到*退火溫度,在一臺PCR儀上同時做多管PCR,每一管放在儀器內(nèi)不同列(有的是不同行)上,分別進行PCR(如50℃~60℃可以分6管,分別為50,52,54,56,58,60度),zui后看看哪個溫度的效果??傊怯脕磉M行退火溫度優(yōu)化的。
降落PCR是在同一個PCR管內(nèi)進行PCR,只是每個循環(huán)的溫度不同(如每個循環(huán)降1度)。一般兼并引物用這種方法多些。
設(shè)計多循環(huán)反應(yīng)的程序,以使相連循環(huán)的退火溫度越來越低。由于開始時的退火溫度選擇為高于估計的Tm值,隨著循環(huán)的進行,退火溫度逐漸降到Tm值,并zui終低于這個水平,用于確保*個引物—模板雜交事件發(fā)生在zui互補的反應(yīng)物之間,即那些產(chǎn)生目的擴增產(chǎn)物的反應(yīng)物之間。盡管退火溫度zui終會降到非特異雜交的Tm值,但此時目的擴增產(chǎn)物已開始幾何擴增,在剩下的循環(huán)中處于*滯后(非特異)PCR產(chǎn)物的地位。由于目標(biāo)是在較早的循環(huán)中避免低Tm值配對,在TD—PCR中應(yīng)用熱啟動技術(shù)。設(shè)計時,退火溫度的范圍應(yīng)跨越15℃左右,從高于估計Tm值至少幾度到低于它10℃。例:一對沒有簡并的引物—模板的計算Tm值為62℃。則:從65℃—>50℃(每2cycles降退火溫度1℃),再在50℃退火溫度下做15個循環(huán)。實驗中如持續(xù)出現(xiàn)假象帶(雜帶),則是因為起始退火溫度太低,或目的擴增產(chǎn)物和非目的產(chǎn)物的Tm值相差無幾,或非目的擴增物以更高的擴增效率擴增,可把退火溫度每降低1℃所需的循環(huán)數(shù)增加到3或4。